استخراج DNA و RNA

گام اولیه تشخیصی در اکثر فرآیندها، استخراج DNA میباشد. به طور مثال در حوزه تشخیص بیماری و یا اختلالات ژنتیکی، استخراج DNA به عنوان طرح اولیه تشخیصی ارائه میشود. از طرفی برای بررسی حضور و عدم حضور ویروس و باکتری در محیط زیست نیز کاربرد دارد. درنهایت این DNA استخراج شده را تحت تجزیه و تحلیل مولکولی از جمله PCR، توالی یابی، الکتروفورز، اثر انگشت و کلونینگ قرار میدهند.

تخلیص DNA استخراج شده

گاهی همراه با مراحل استخراج DNA، آلودگی هایی چون پروتئین ها، نمک های بافری و یا آنزیم ها را همراه خواهد داشت؛ در این شرایط میبایست درصدد تخلیص DNA استخراج شده برآمد. در ادامه 5 روش متداولی که برای خالص سازی استفاده میشوند را معرفی میکنیم:

• استخراج فنول/کلروفورم
• رسوب با اتانول
• کیت هایی بر مبنای ستون های سیلیس
• رزین های Startaclean
• مهره های (beads) آهنربایی

اولین گام و یکی از نیازهای اساسی مطالعات زیستی و مولکولی، استخراج RNA با کمیت و کیفیت بالا در بسیاری از تست‌های معمول آزمایشگاهی است. استخراج RNA با خلوص مناسب  و کیفیت مطلوب برای بسیاری از کاربری ها چون کلونینگ، رونویسی معکوس برای سنتز cDNA ،RT-PCR ،RT-qPCR ،Northern blotting ،cDNA microarray  و RNA-seq بسیار مهم می‌باشد.

توجه: دو ترکیب DNA و RNA در طول موج 260 نانومتر جذب دارند؛ لذا اگر در روند استخراج RNA، مولکول های DNA هم به عنوان آلودگی خارج شده باشند، در این ناحیه تداخل خواهند داشت. در این شرایط دو راه حل وجود دارد:

1. استفاده از آنزیم DNase در بافر حاوی Ca²⁺ و Mg²⁺ جهت تخریب آلودگی DNA ژنومی
2. استفاده از روش های فلورمتری مانند کیوبیت که می تواند به طور خاص کمیت اسیدهای نوکلئیک را تعیین کند.

کنترل کیفیت RNA استخراج شده

برای بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج شده میتوان به روش های متعددی عمل نمود:

• تعیین خلوص RNA یا RNA Purity
• بررسی باندهای RNA ریبوزومی
• بررسی یکپارچگی RNAیا RNA integrity
• تعیین غلظت RNA استخراج شده با استفاده از دستگاه نانودراپ اسپکتروفتومتر

دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ جذب نوری این ترکیبات را سنجش میکند. به عبارتی می توان از آن برای اندازه گیری طیف جذبی یا تک طول موج های این ماکرومولکول ها در محلول استفاده کرد. این نرم افزار دارای الگوریتم هایی است که به طور خودکار غلظت DNA، RNA یا پروتئین را از میزان جذب اندازه گیری شده محاسبه می کند. همچنین دارای الگوریتم هایی برای سنجش رنگ سنجی خاص برای پروتئین مانند سنجش های برادفورد، پیرس یا لوری است.

اسپکتروفتومتر-نانودراپ یک ابزار آزمایشگاهی رایج است که این امکان را به کاربر میدهد تا در کمتر از یک دقیقه اندازه گیری را انجام دهد؛ چرا که از حجم نمونه خیلی کمی (~1 میکرولیتر) استفاده میکند. حجم نمونه کوچکی به معنای کاهش زمان آماده سازی و تمیز کردن و صرفه جویی در وقت است. نکته کلیدی این اسپکتروفتومتر پیشرفته، فناوری منحصربه‌فرد نگهداری نمونه آن است که علاوه بر کووت میتوان با قرار دادن نمونه مستقیماً در بالای سطح تشخیص مسیر نوری اندازه گیری را  با استفاده از کشش سطحی برای ایجاد ستونی بین انتهای فیبرهای نوری ایجاد نمود. امکان بایگانی تعداد زیادی از آنالیزها توسط کامپیوتر وجود دارد. از طرفی این امکان را میدهد نمونه های بیوشیمی، ژنومیکس و پروتئومیکس را به لحاظ کنترل کیفیت بهینه نمایید.

محدوده حساسیت برای تشخیص DNA بین 2 تا 3700 نانوگرم در لیتر است. محدوده طیفی دستگاه 190 تا 900 نانومتر است و امکان اسکن تمام طول موج ها وجود دارد. یک چرخه اندازه گیری تنها 10 ثانیه طول می کشد.

تفسیر منحنی های دستگاه نانودراپ اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومتر NanoDrop در اندازه‌گیری طیف گسترده‌ای که پرتوهای فرابنفش و نور مرئی را در بر می‌گیرد، این یک ویژگی بسیار کاربردی است؛ با این حال، نمی تواند به طور خودکار تعیین کند که نمونه روی پایه DNA، RNA یا پروتئین است. شما باید قبل از اندازه گیری این اطلاعات را به نرم افزار بدهید تا بتواند غلظت دقیق را گزارش دهد.

با توجه به مقادیر مختلف پیوندهای دوگانه کربن-کربن در اسید نوکلئیک و پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک حداکثر جذب در 260 نانومتر و پروتئین ها حداکثر جذب در 280 نانومتر دارند. اگر آلودگی پروتئینی، آلودگی به حلال های آلی و نمک ها و کربوهیدرات ها وجود داشته باشد، میزان جذب به طور چشمگیری تغییر می کند. بررسی طیف جذبی ترکیبات اطلاعات زیادی در اختیار کاربر قرار میدهد؛ در منحنی باید یک پیک خوب در 260 نانومتر وجود داشته باشد که نشان دهنده وجود اسیدهای نوکلئیک است و هیچ قله ای در جای دیگر وجود ندارد. اگر پیک های دوگانه یا جابجایی در منحنی وجود داشته باشد، اینها علائم هشداری هستند که نشان می دهد نمونه خالص نیست.

اسپکتروفتومتر NanoDrop نسبت A260/280 را در اختیار شما قرار می دهد تا بتوانید کیفیت نمونه خود را ارزیابی کنید. نسبت‌های A260/280 می‌توانند به شما در رفع مشکلات مربوط به آلودگی نمونه کمک کنند. در واقع این امکان را فراهم میکند که خلوص را هم مانند غلظت اندازه گیری نمایید. برای نمونه های RNA نسبت 260 به 280 برابر 1±2 و برای نمونه های DNA (C ~ 10 ng/µL) نسبت 260 به 280 برابر 1± 8/1 قابل قبول است. حضور بازهای اوراسیل(U) در RNA خالص دلیلی بر افزایش نسبت RNA خالص نسب به DNA است.

نکته قابل توجه دیگر، مقدار A260/230 شما است، که مانند همتای نسبت A260/280 خود باید برای نمونه های RNA و DNA  بالاتر از 2 و کمتر از 2.4 باشد. (به عنوان یک قانون سرانگشتی).