آنچه که باید در مورد ریل تایم پی سی آر بدانیم.

واکنش زنجیره ای پلیمراز لحظه به لحظه (Real time PCR) ، از جمله روش های آزمایشگاهی زیست شناسی مولکولی بر مبنای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است. در این روش مقدار واقعی محصول PCR موجود در یک سیکل معین را تعیین می کند. با استفاده ازنشانگر فلورسنت در واکنش PCR، این فرآیند به شما امکان می دهد تکثیر DNA را در روش qPCR اندازه گیری کنید.

معمولا روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) با استفاده از دستگاه ترموسایکلر صورت می گیرد. در روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) رایج، تکثیر یک مولکول DNA مورد هدف قرارگرفته در پایان واکنش بطور کمی می تواند مورد سنجش قرار می گیرد، در حالی که در واکنش زنجیره ای پلیمراز زمان واقعی ((Real time PCR مراحل  تکثیر مولکول DNA مورد هدف قرارگرفته لحظه به لحظه و در طول زمان با استفاده از نشانگر فلورسنت قابل مشاهده و ارزیابی می باشد لذا این روش به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (qPCR) نیز شناخته می شود.

به بیان دیگر، دستگاهReal Time PCR  از دستگاه ترمال سایکلر  پیشرفته تر است و علاوه بر اینکه یک دستگاه ترمال سایکلر بوده بلکه دارای بخش آشکار ساز نوری و  نرم افزار پیچیده برای گرفتن اطلاعات کمیDNA  نیز می باشد. درواقع  سنجش اپتیکی DNA  ها بصورت لحظه به لحظه (real time) در تمامی مراحل تکثیر انجام می شود.

دو روش برای اندازه گیری DNA تکثیر شده برای Real time PCR وجود دارد:

روش اول : استفاده از نشانگرهای فلورسنت غیر اختصاصی با استفاده از رنگ مانند (SYBR® Green)

در این روش مشاهده هر توالی DNA دو رشته ای فراهم می شود. نیازی به پروب ندارد و در نتیجه راه اندازی سنجش و هزینه های جاری را کاهش می دهد. همچنین، چندین رنگ می توانند به یک مولکول تکثیر شده متصل شوند که حساسیت را برای تشخیص محصولات تکثیر شده را افزایش می دهد.

در واکنش  SYBR Green qPCR به یک الگوی که شامل  توالی هدف موردنظر شما باشد، همچنین به پرایمرها یا قطعات کوچک DNA جهت تکثیر، چهار باز سازندهDNA  یا dNTPs dTTP) (dATP, dCTP, dGTP, و آنزیم DNA  پلیمراز مورد نظر نیاز است. رنگ SYBR Green معمولاً در مخلوط واکنش که حاوی آنزیم DNA  پلیمراز است، در بر گرفته می شود.

واکنش زنجیره های پلیمراز ریا تایم شامل یک سری سیکل های تکرار شونده (معمولا 35 – 40 سیکل ) می باشد و هر یک از این سیکل ها شامل چهار مرحله می باشد:

1. مرحله باز شدن دو رشته (denaturation ) اولین مرحله در واکنش PCR است. ترموسایکلر تا حدود 95 درجه سانتیگراد گرم می شود که باعث می شود مارپیچ DNA دو رشته ای  بصورت دو   DNA تک رشته ای باز شود.

2. در مرحله اتصال پرایمرها به هدف (annealing) ، دما بین 45-65 درجه سانتیگراد خنک می شود و پرایمرهای تک رشته ای به انتهای مناسب توالی هدف متصل می شوند. در طول سیکل، آنزیم DNA  پلیمراز به الگوی اولیه متصل می شود و شروع به ترکیب نوکلئوتیدهای مکمل می کند.

3.در نهایت، ساخت یا طویل سازی رشته مکمل هدف (extention) ،در این زمان دما به آرامی به 65-75 درجه سانتیگراد افزایش می یابد. آنزیم  DNA پلیمراز، پرایمر اختصاصی توالی را با اتصال دادن نوکلئوتیدهایی که مکمل الگوی DNA هستند گسترش می دهد.

4.I  SYBR Green ها به تمام کمپلکس های DNA دو رشته ای تازه سنتز شده متصل میشود و نور فلورسانس ساطع می کنند. با ادامه سیکل PCR، نورهای نور فلورسنت تجمع می یابند و در پایان هر سیکل PCR اندازه گیری می شوند. شدت فلورسانس تولید شده توسط SYBR Green I بالاتر از سطح پس‌زمینه (مقدار Cq) اندازه‌گیری می‌شود و برای اندازه‌گیری مقدار DNA دو رشته‌ای تازه تولید شده استفاده می‌شود.

پس از آنکه سیکل40-35 بار انجام شد، داده ها برای شروع تجزیه و تحلیل آماده است. مقادیر Cq را می توان برای تعیین کمیت مقادیر اولیه DNA، ایجاد یک منحنی استاندارد برای مطالعات بیان ژن یا سایر تجزیه و تحلیل ها استفاده کرد.

دقت داشته باشید تنظیم حرارت در دماهای مورد نظر و زمان و همچنین تعداد سیکل ها با استفاده از دستگاه real time PCR   صورت می گیرد. همچنین انتخاب منبع نور و دتکتور  برای طول موج بر انگیختگی و برای طول موج نشر رنگ مورد نظردر تنظیمات دستگاه لحاظ می شود.

روش دوم : استفاده از نشانگرهای فلورسنت اختصاصی با استفاده از پروب

qPCR  مبتنی بر پروب، امکان هیبریداسیون مدنظر را فراهم می کند. ماهیت هدفمند qPCR مبتنی بر پروب منجر به پس زمینه کم می شود و حضور مثبت کاذب را حذف می کند. همچنین می‌توانید پروب‌ها را با رنگ‌های گزارشگر متفاوت و قابل تشخیص برچسب بزنید تا امکان تکثیر دو توالی مجزا در یک لوله واکنش فراهم شود.

در یک واکنش qPCR مبتنی بر پروب، به یک الگو شامل توالی هدف موردنظر، همچنین به پرایمرها یا قطعات کوچک DNA جهت تکثیر، چهار باز سازندهDNA  یا dNTPs dTTP) (dATP, dCTP, dGTP, و آنزیم DNA  پلیمراز مورد نظر نیاز است. علاوه بر این، به یک پروب که دارای برچسب مولکول گزارشگر و مولکول خاموش کننده باشد نیاز است. به طور معمول پروب ها به عنوان محصولات جداگانه و سفارشی فروخته می شوند زیرا برای توالی هدف خاصی هستند.

1. مرحله باز شدن دو رشته (denaturation ) اولین مرحله در واکنش PCR است. ترموسایکلر تا حدود 95 درجه سانتیگراد گرم می شود که باعث می شود مارپیچ DNA دو رشته ای  بصورت دو  DNA تک رشته ای باز شود.

2.در مرحله اتصال پرایمرها به هدف ( annealing ) ، دما بین 45-65 درجه سانتیگراد خنک می شود و پرایمرهای تک رشته ای به انتهای مناسب توالی هدف متصل می شوند. در طول سیکل ،آنزیم DNA پلیمراز به الگوی اولیه متصل می شود و شروع به ترکیب نوکلئوتیدهای مکمل می کند.

3.در نهایت، ساخت یا طویل سازی رشته مکمل هدف (extention) ،در این زمان دما به آرامی به 65-75 درجه سانتیگراد افزایش می یابد. در این مرحله، آنزیم DNA پلیمراز، پرایمر اختصاصی توالی را با اتصال دادن نوکلئوتیدهایی که مکمل الگوی DNA هستند گسترش می دهد. سپس آنزیم DNA پلیمراز مولکول گزارشگر را از پروب جابجا می کند و در نتیجه سیگنال فلورسانس ایجاد می شود.

با ادامه سیکل PCR،  فلورسانس های ساطع شده تجمع می یابد و در پایان هر سیکل PCR اندازه گیری می شود. شدت نور فلورسنت تولید شده توسط مولکول گزارشگر بالاتر از سطح پس‌زمینه (مقدار Cq) اندازه‌گیری می‌شود و برای کمی کردن مقدار رشته‌های DNA دو رشته‌ای جدید تولید شده استفاده می‌شود.

qPCR مبتنی بر پروب یک گزینه عالی برای هیبریداسیون خاص، بدون مثبت کاذب، و تکثیر دو توالی مجزا در یک لوله واکنش است.

منحنی تکثیر PCR و فاز های مختلف آن

نتایج یک تست Real-time PCR معمولا به وسیله منحنی های تکثیر نمایش داده می شوند. اگر میزان تکثیر محصول در Real-time PCR را بر حسب سیکل در یک نمودار ترسیم کنیم، منحنی تکثیر PCR بدست می آید. یک نمونه معمولی از این منحنی در زیر نشان داده شده است. منحنی به صورت S شکل (sigmoidal) باید باشد. همانطور که گفته شد هر این نمودار میزان تکثیر محصول PCR را بر حسب سیکل را نمایش می دهد. یک تست PCR واقعی به صورت نوعی 45 سیکل دارد.

این منحنی از سه فاز اصلی تشکیل شده است، شکل زیر را ببینید.

فاز  خط پایه (baseline)

در شروع یک تست، مقدار محصول PCR کم است، بنابراین مقدار سیگنال فلوئورسنت بسیار ضعیف است.  ممکن است مقدار اندکی نوسانات یا جهش های کوچک در منحنی تکثیر در طول سیکل های اولیه وجود داشته باشد که این ها ناشی از سیگنال پس زمینه یا نویز هستند که به دلیل سیگنال فلوئورسنت بسیار ضعیف در سیکل های اولیه اتفاق می افتند. به صورت نوعی این بازه از نمودار بین سیکل های 0 تا 15 است. به این بازه از نمودار فاز  خط پایه (baseline) یا linear-ground phase می گویند.

فاز نمایی (exponential)

فاز نمایی منطقه ای را از نمودار مشخص می کند که محصولات PCR شروع به تکثیر می کنند، در حالت ایده آل مقدار آن (محصولات PCR) در هر سیکل دو برابر می شود. اما به دلایل مختلف مقدار تکثیر دقیقا برابر دو نیست و مقداری نزدیک به آن است. فاز نمایی بعد از فاز خط پایه (baseline) شروع می شود.

فاز خطی (linear)

فاز خطی بعد از فاز نمایی قرار دارد در این مرحله محصول PCR رشد می کند تا به حداکثر رشد خود برسند، اما رشد در این مرحله به جای این که به صورت نمایی باشد، خطی است.

فاز صاف (plateau)

بعد از ان که اجزای واکنش مصرف شدند، تکثیر محصول PCR نهایتا به مقدار نهایی خود می رسد. در طول این فاز واکنش به ثبات می رسد و هیچ افزایشی در محصول PCR مشاهده نمی شود. این مرحله در سیکل های پایانی اتفاق می افتد. (برای مثال سیکل 26 تا 38).

بازدهی تکثیر در PCR

بازدهی تکثیر، یا همان efficiency، یکی دیگر از پارامتر های مهم برای بررسی داده های PCR است. در شرایط ایده آل، تعداد  توالی های (sequences) DNA در هر سیکل دو برابر می شود. در این شرایط بازده ای واکنش 100% است. با این اوصاف به دلیل عواملی مثل: مهار کننده های واکنش، آنزیم ها، و تفاوت پرایمر و پروب ها، بازده ای واکنش به ندرت 100% می شود. بنابراین بازده ای عددی حدود 100 درصد است.

برای تعیین مقدار efficiency باید منحنی استاندار رسم شود. سپس مقدار بازده ای را می توان از رابطه ی زیر بر اساس شیب منحنی استاندارد بدست آورد: