اصول اولیه OD600

اندازه گیری تراکم نوری (OD) رشد میکروبی و سلولی یکی از رایج ترین روش های مورد استفاده در آزمایشگاه میکروبیولوژی است. برخی از کاربردهای اصلی عبارتند از تعیین زمان بهینه برای برداشت، تعیین زمان بهینه برای القای کشت هنگام اجرای پروتکل بیان پروتئین یا نظارت بر روش های شبیه سازی.

رشد سلول ها، باکتری ها یا مخمر (تراکم سلولی، رشد باکتری، رشد مخمر) در محیط های کشت مایع معمولاً با اندازه گیری چگالی نوری در 600 نانومتر (OD600) کنترل می شود. اندازه‌گیری‌های OD600 معمولاً برای تعیین مرحله رشد یک کشت باکتریایی استفاده می‌شوند، این اندازه‌گیری‌ها کمک می‌کند تا اطمینان حاصل شود که سلول‌ها در نقطه بهینه‌ای که مربوط به تراکم مناسب سلول‌های زنده است، برداشت می‌شوند. از اسپکتروفتومتر برای خوانش OD600 استفاده می شود. نانودراپ و دستگاه میکروپلیت ریدر چندمنظوره مثالی از دستگاه هایی هستند که به طور اختصاصی برای این منظور استفاده میشوند.

از آنجایی که چگالی نوری در مورد اندازه‌گیری‌های OD600 ناشی از پراکندگی نور به جای جذب نور است، اندازه و شکل و همچنین سلول‌های مرده و بقایای سلول ممکن است به اتلاف نور اضافه کنند. بنابراین، انواع سلول های متمایز که در تراکم یکسان هستند (به عنوان مثال سلول در میلی لیتر) ممکن است مقادیر متفاوتی از OD600 را هنگام تخمین زدن بر روی یک ابزار مشابه نشان دهند. جذب نور در نمونه شفاف و پراکندگی نور در نمونه کدر در زیر نمایش داده شده است. 

رشد سلول های باکتریایی به طور معمول از طریق یک سری مراحل متوالی از جمله تاخیر، ورود به سیستم، ساکن و کاهش پیشرفت می کند. به طور کلی، سلول ها باید در انتهای فاز لگاریتم با استفاده از چگالی نوری نمونه ها برای تعیین زمان رسیدن به این نقطه برداشت شوند. سلول ها به طور معمول رشد می کنند تا زمانی که جذب در 600 نانومتر (معروف به OD600) به حدود 0.4 قبل از القا یا برداشت برسد. منحنی رشد سلول در زیر نمایش داده شده است.

تفاوت در خواندن OD600

برای نمونه‌های کدر مانند کشت‌های سلولی، عامل اصلی جذب اندازه‌گیری شده، پراکندگی نور است و نه نتیجه جذب مولکولی طبق قانون بیر-لامبرت. بنابراین، اندازه‌گیری‌ها به تنظیمات نوری اسپکتروفتومتر بستگی دارد (فاصله بین نگهدارنده سلول و شکاف خروجی ابزار، اپتیک تک رنگ، هندسه شکاف، و غیره)، انواع مختلف ابزار به احتمال زیاد تمایل به خوانش OD 600 متفاوت برای یک کدورت دارند. نمونه. بنابراین، اگر قرار است نتایج حاصل از اسپکتروفتومترهای مختلف با هم مقایسه شوند، ابتدا باید با یک همبستگی ساده از قرائت‌های OD با استفاده از یک نمونه مشابه روی دو ابزار مختلف، نرمال‌سازی شوند.

                                                                                                Correction Factor = OD600 Instrument 1 / OD600 Instrument 2 

یا با رویکردی دقیق تر با ایجاد منحنی های کالیبراسیون مناسب.

منحنی کالیبراسیون را می توان با مقایسه OD 600 اندازه گیری شده با OD 600 مورد انتظار در طیف وسیعی از غلظت های مختلف ساخت. OD 600 مورد انتظار با شمارش تعداد سلول با استفاده از یک روش جایگزین (به عنوان مثال روش اسلاید میکروسکوپ) و تبدیل به OD 600 با استفاده از قانون کلی که 1 OD 600 = 5 x 108 سلول در میلی لیتر برای E. coli تعیین می شود. ابزاری با کیفیت بالا مانند نانودراپ اسپکتروفتومتر یا دستگاه میکروپلیت ریدر چند منظوره دارای "ضریب تصحیح" 1 به عنوان پیش فرض است که پس از تنظیم به ارائه نتایج قابل مقایسه بین تجهیزات مختلف کمک می کند.

استفاده از کووت های یکبار مصرف به جای فناوری های حجم میکرو/نانو (اندازه گیری در یک قطره) برای اندازه گیری تراکم نوری محلول های کشت سلولی توصیه می شود. مقدار سلول ها در خواندن منعکس می شود و احتمال نوسان تعداد سلول ها در یک افت از نمونه ای به نمونه دیگر را می توان بسیار مهم در نظر گرفت. بنابراین توصیه می‌شود از کووت‌ها استفاده کنید زیرا میزان خطا در حجم بزرگ‌تر چندان قابل توجه نیست. اندازه‌گیری‌های کووت میانگین بزرگ‌تری و در نتیجه خوانش‌های تکرارپذیرتری ارائه می‌کنند. همچنین، برای جلوگیری از ته نشین شدن خیلی سریع سوسپانسیون و دادن یک قرائت OD که با گذشت زمان تغییر می کند، گلیسرول باید به نمونه اضافه شود.